Sondeando a escala fina conexiones en el cerebro

La inteligencia artificial y la microscopía mejorada hacen posible mapear el sistema nervioso con una resolución cada vez mayor.

Hay 70 millones de neuronas en el cerebro del ratón y Moritz Helmstaedter quiere mapearlas todas. Era estudiante de medicina en la Universidad de Heidelberg, en Alemania, cuando los psiquiatras sugirieron que algunos aspectos de la psique humana carecen de una explicación biológica. «Estaba totalmente consternado«, recuerda Helmstaedter, que ahora es director del Instituto Max Planck para la Investigación del Cerebro en Frankfurt, Alemania.

Aunque el cerebro sigue siendo un misterio, Helmstaedter estaba convencido de que lo que sucede allí «debe ser al final un fenómeno mecanicista, por complejo que sea». Ha dedicado las últimas dos décadas a trabajar con esos mecanismos, y él y otros neurocientíficos finalmente están comenzando a arañar la superficie, un micrómetro cúbico a la vez.

A partir de los ’70, tomó más de una década desentrañar los circuitos neuronales del gusano de un milímetro, Caenorhabditis elegans. Al sondear la relación entre los genes y el comportamiento, el biólogo Sydney Brenner y sus colegas del Laboratorio de Biología Molecular del MRC en Cambridge, Reino Unido, trazaron laboriosamente las ramas finas y las conexiones sinápticas de cada célula nerviosa, codificándolas a mano por colores en miles de impresiones de micrografías electrónicas. Ese mapa de cableado (el primer y único conjunto completo de conexiones sinápticas en el sistema nervioso de un animal) se almacenó en una computadora del tamaño de una habitación y se publicó como el primer «conectoma» animal completo en 1986, en una obra de 340 páginas.

El gusano Caenorhabditis elegans tiene menos de 400 neuronas; los cerebros humanos tienen 86 mil millones. Entonces, por ahora, los científicos están apuntando a un hito intermedio: mapear los circuitos neuronales a escala fina del ratón.

Incluso con alrededor de 1.000 veces menos células, el cerebro del ratón plantea un desafío formidable, dice Jeff Lichtman, neurocientífico de la Universidad de Harvard en Cambridge, Massachusetts, quien es uno de los líderes de un consorcio global que tiene como objetivo reconstruir el cableado neuronal de un cerebro de ratón durante la próxima década. «Estamos tratando con un conjunto de datos que estará en la escala de un exabyte». Un exabyte equivale a mil millones de gigabytes; todo el genoma humano se puede representar en aproximadamente 1,5 gigabytes. En términos de tamaño de los datos, el mapeo del conectoma del cerebro del ratón será «enorme en comparación con cualquier cosa que se haya hecho como un solo proyecto», dice. «Los conectomas son magníficamente complicados».

Sin embargo, la tecnología para hacer posible tal empresa está cerca. Con los avances en microscopía y la inteligencia artificial (IA), y la ayuda colaborativa de jugadores humanos, los investigadores están comenzando a mapear redes neuronales y sus conexiones a una resolución y escala cada vez mayores. En los últimos años, se han enfocado en pequeñas partes del cerebro, incluidas partes de la retina y la corteza cerebral de los mamíferos. Y en septiembre, los investigadores que trabajaban con moscas de la fruta Drosophila informaron de la reconstrucción más grande hasta ahora: 25.000 neuronas en el hemibrain, un cubo de tejido que mide 250 micrómetros de lado y representa el 40% del cerebro de la mosca.

Estos no son meros ejercicios de biología grande. A medida que la conectómica empuja los límites tecnológicos y computacionales, los investigadores esperan aprovechar estos conjuntos de datos para aprender cómo se almacenan las experiencias en el cerebro, con información potencial sobre el autismo, la esquizofrenia y otras «conectopatías».

Desarrollos tempranos

Después de que el diagrama de cableado neural del gusano C. elegans lanzara la conectómica en 1986, el campo se quedó en silencio, dice Helmstaedter. Era una cuestión de tecnología: los investigadores no tenían forma, más allá de lo que había hecho el equipo de Brenner, de sondear los circuitos neuronales a escalas de conectoma.

Como estudiante de doctorado, a principios de la década de 2000, Helmstaedter insertó electrodos en las células nerviosas para averiguar cuáles estaban conectadas eléctricamente, un enfoque que podría permitir la grabación simultánea de cuatro o cinco neuronas. Sin embargo, las redes tienen cientos o miles de células nerviosas y millones de conexiones. «Para mapear realmente los circuitos, necesitábamos algo más», dice.

Eso ocurrió en 2004. Winfried Denk (entonces en el Instituto Max Planck de Investigación Médica en Heidelberg) y sus colegas, instalaron una herramienta de corte de precisión llamada microtomo en la cámara de vacío de un microscopio electrónico (EM), haciendo posible la automatización de imágenes a nanoescala. Esto revitalizó el campo.

El método de Denk, denominado microscopía electrónica de barrido de caras de bloques en serie (SBEM), implica cargar un bloque de tejido en la máquina, que luego automáticamente toma imágenes de la cara expuesta, raspa la capa superior de tejido y repite, durante días o semanas. En 2013, el equipo de Denk, dirigido por Helmstaedter, un ex postdoctorado en laboratorio, utilizó SBEM para mapear un conjunto completo de conexiones sinápticas para 950 neuronas en la retina del ratón. Esta fue una empresa importante: el costo, incluido el equipo, los salarios y unos 300.000 euros (350.000 dólares estadounidenses) en tasas pagadas a los estudiantes de pregrado para rastrear circuitos a lo largo de los conjuntos de datos de EM, ascendió a unos 2 millones de euros. Y reveló nuevos subtipos de células. Pero más allá de eso, el trabajo proporcionó un mapa completo para que los investigadores identifiquen socios de interacción para las células de interés, dice Helmstaedter, «como usar un mapa de calles para la navegación en lugar de prueba y error».

Matemáticas de gusano

Los estudiantes que rastrearon esos circuitos neuronales lo hicieron usando computadoras. Ese cambio comenzó a principios de la década de 2000, cuando los investigadores comenzaron a adoptar un enfoque computacional para mapear el conectoma. Esto no fue aprendizaje automático; los humanos todavía hacían el trabajo. Pero en lugar de trazar neuronas en papel con lápices de colores como había hecho el equipo de Brenner, hicieron clic con el mouse en pilas de imágenes digitalizadas.

El biólogo Scott Emmons, del Albert Einstein College of Medicine en la ciudad de Nueva York, y su equipo, por ejemplo, digitalizaron las imágenes originales de Brenner y utilizaron un enfoque computacional para mapear los circuitos que regulan los comportamientos de apareamiento en la cola de un C. elegans macho. (El esfuerzo de 1986 se centró en el otro sexo de C. elegans, el hermafrodita).

Conectoma del cerebro adulto de Caenorhabditis elegans
Crédito: D. Witvliet et al./bioRxiv

Luego, Emmons contrató a un estadístico para que aplicara la teoría de grafos, una rama de las matemáticas que se utiliza para analizar redes, como rutas de autobús o mapas de propagación de enfermedades, para calcular la fuerza de las conexiones sinápticas y determinar qué partes de la red del conectoma impulsan comportamientos específicos. Aunque los matemáticos habían estudiado las redes neuronales artificiales durante décadas, el trabajo en el C. elegans, informado en 2012, se consideró el primer análisis cuantitativo de una red neuronal natural, dice Emmons.

Ampliando esos esfuerzos, en 2019 Emmons y sus colegas publicaron conectomas cuantitativos de los sistemas nerviosos completos de ambos sexos de C. elegans, que comprenden 687 neuronas. Uno de los objetivos era determinar en qué se diferenciaba la conectividad entre el macho y el hermafrodita. Pero distinguir las diferencias basadas en el sexo de la variabilidad biológica natural entre los individuos resultó ser un hueso duro de roer, retrasando el artículo un año completo y requiriendo aún más matemáticas. Al final, el equipo concluyó que hasta el 30% de las conexiones neuronales podrían reflejar verdaderas diferencias basadas en el sexo, dice Emmons, a diferencia de las disparidades que surgen de las condiciones de crianza o errores metodológicos.

Complejidad inesperada

El rastreo de los circuitos neuronales a través del cerebro de un gusano diminuto requiere miles de secciones de 30 a 50 nanómetros. «Incluso si eres un dios, no puedes cortar 5.000 secciones sin estropear nada», dice Mei Zhen, neurocientífica de la Universidad de Toronto en Canadá.

Ahora intenta hacer eso ocho veces. En un análisis descrito en una preimpresión de bioRxiv en mayo, los investigadores dirigidos por Zhen, Lichtman y el físico de Harvard Aravinthan Samuel, reconstruyeron conectomas en ocho etapas de desarrollo para aprender cómo cambia el diagrama de cableado de C. elegans a medida que el gusano madura de larva temprana a adulto. Seccionaron la mayoría de sus muestras con un ultramicrótomo recolector de cinta automatizado, desarrollado en el laboratorio de Lichtman, que recolecta secciones seriadas y las coloca en secuencia en un carrete para obtener imágenes posteriores con un microscopio electrónico de barrido. «Convierte un gusano en un rollo de cinta», dice Zhen.

Utilizándolo, el equipo detectó enormes diferencias en el cableado de los gusanos. Incluso entre animales genéticamente idénticos, dice Zhen, alrededor del 43% de las conexiones no eran las mismas.

En el Laboratorio de Biología Molecular del MRC, la neurocientífica de sistemas Marta Zlatic estudia otra criatura parecida a un gusano: las larvas de Drosophila. Las larvas, que miden entre 4 y 8 milímetros de longitud, son más grandes que C. elegans, pero tienen entre 10 y 20 veces menos neuronas cerebrales que las moscas adultas. «De modo que podemos reconstruir circuitos mucho más rápido, y podemos hacerlo en muchos individuos», dice Zlatic, quien combina la conectómica con otras técnicas para correlacionar la estructura neuronal con la función.

En un estudio publicado en marzo, el equipo de Zlatic analizó 102 pares de neuronas involucradas en la evitación del olor. Descubrieron que incluso en estos pequeños insectos, las redes celulares lejanas regulan el aprendizaje. «Cuando un animal aprende algo nuevo sobre un olor, la rapidez y la eficacia con la que aprende eso se verá influenciado por todo lo demás que haya aprendido sobre ese olor», dice.

Aprendizaje automático

Ampliar dichos análisis a animales como Drosophila adultos o ratones, que son capaces de un aprendizaje de orden superior, es mucho más desafiante. Pero allí también se están haciendo progresos.

En un estudio de 2019, Helmstaedter y sus colegas utilizaron SBEM para obtener imágenes y reconstruir una partícula del cerebro de un ratón en una región que procesa la información sensorial. Con una medida de 500.000 micrómetros cúbicos, el volumen contenía unos 2,7 metros de cableado neuronal y 400.000 conexiones sinápticas. Contenía solo 89 neuronas, pero era 300 veces más grande que las reconstrucciones anteriores de la corteza cerebral de los mamíferos.

Reconstruir estos circuitos con las técnicas estándar en ese momento (pasar de un corte a otro, rastrear manualmente cada célula nerviosa) habría llevado cientos de miles de horas, estima Helmstaedter. Por lo tanto, su equipo combinó algoritmos de procesamiento de imágenes automatizados con enfoques de inteligencia artificial de aprendizaje automático, y centró el esfuerzo humano en marcar las ramas neuronales mientras dejaba que las computadoras se encargaran de la reconstrucción volumétrica. Esto redujo la carga de trabajo a 20.000 horas, lo que sigue siendo el equivalente a 10 personas trabajando a tiempo completo durante un año. Otras mejoras en la inteligencia artificial aceleraron aún más el proceso, capacitando a las computadoras para evaluar las reconstrucciones ensambladas por la máquina y solicitando ayuda humana solo cuando fuera necesario.

Mientras tanto, los investigadores del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) en Ashburn, Virginia, pusieron sus ojos en Drosophila. El cerebro de una mosca de la fruta tiene muchas menos neuronas que el de un ratón, pero sus cables son más delgados y están más densamente empaquetados, dice Shan Xu, física aplicada de Janelia. Rastrear estas conexiones hasta su finalización requeriría una resolución de 8 nm, de 3 a 6 veces más de lo que era posible con el escaneo EM cuando Xu se unió al HHMI en 2009. Dada la tecnología disponible entonces, dice, las imágenes por sí solas hubieran tomado una década.

Y ese ni siquiera fue el mayor desafío. Para rastrear cada proceso neuronal a esta resolución, las imágenes tenían que ser perfectas; una brecha de 100 nm podría inutilizar el conjunto de datos. «Quería operar una máquina durante una década sin errores», dice Xu.

Xu pasó varios años investigando minuciosamente los modos de falla y las condiciones que los desencadenaron. «Antes de que falle, ¿cuáles son las señales reveladoras? ¿Cuáles son los indicadores que puedo capturar y detener inmediatamente la operación? Y luego, ¿cómo puedo reiniciar desde allí sin problemas?» se preguntó. En lugar de la perfección, optó por la inteligencia, construyendo un sistema que podría apagarse por sí mismo cuando se avecina una falla en la computadora, falla de la bomba de vacío u otro mal funcionamiento. Ese cambio de mentalidad «cambió por completo el panorama», dice Xu. Ayudó a su equipo a refinar otra tecnología de cara de bloque, FIB-SEM, que corta utilizando un haz de iones enfocado, en lugar de un micrótomo, y produce imágenes de mayor resolución con pocos defectos.

Xu y sus colegas ejecutaron dos de estos sistemas FIB-SEM en paralelo durante aproximadamente dos años. Luego, después de que una computadora alineó las pilas de imágenes EM, un equipo de 50 empleados de HHMI trabajó a tiempo completo durante un año para corregirlas. Al examinar miles de imágenes por día, los correctores de pruebas aprendieron rápidamente a detectar errores, por ejemplo, segmentos mal unidos o piezas huérfanas que debían conectarse. «Desarrollas tu ojo para el tipo de neurona que estás mirando», dice Erika Neace, una desarrolladora de análisis y correctora de pruebas veterana en Janelia. En total, el equipo rastreó 25.000 neuronas y sus 20 millones de conexiones en el hemibrain3.

Por separado, otro equipo de Janelia tomó imágenes del cerebro de la mosca utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), una tecnología más antigua que pasa electrones a través de muestras delgadas en lugar de escanear una superficie como lo hace FIB-SEM. Al equipar el microscopio con una serie de cámaras y componentes robóticos para procesar muestras más grandes a velocidades más altas, obtuvieron imágenes de un cerebro de Drosophila adulto completo. Luego validaron el conjunto de datos resultante, los 106 terabytes del mismo, rastreando meticulosamente los circuitos en el cuerpo del hongo, una estructura cerebral importante para el aprendizaje y la memoria.

Hoy en día, los investigadores están colaborando con el proceso de anotación, creando juegos en línea como bancos de prueba para la conectómica a gran escala utilizando inteligencia artificial y voluntarios humanos. En agosto, los investigadores, dirigidos por los neurocientíficos Sebastian Seung y Mala Murthy de la Universidad de Princeton en Nueva Jersey, lanzaron una plataforma similar a un juego llamada FlyWire, que presenta piezas de neuronas identificadas por IA del conjunto de datos de cerebro de mosca de Janelia para que los jugadores las ensamblen. Basado en Eyewire, un juego anterior desarrollado por el laboratorio de Seung que utiliza un conjunto más pequeño de imágenes de retina de ratón, FlyWire complementa la plataforma de visualización Neuroglancer de Google con herramientas que permiten a varios usuarios ver y editar neuronas en el mismo conjunto de datos al mismo tiempo.

A diferencia de la reconstrucción del hemibrain de Xu, que fue procesada por un equipo interno de revisión, FlyWire invita a todos a que contribuyan. Y esas contribuciones mejoran el sistema con el tiempo, dice Seung. Cuando un usuario edita una neurona haciendo clic en un botón para dividir o fusionar piezas, esa acción envía un mensaje que entrena a la máquina para detectar reconstrucciones erróneas y, con el tiempo, corregirlas. «Este es un momento realmente profundo, filosóficamente interesante», dice Lichtman. «Las máquinas están aprendiendo a ser más inteligentes al estudiar el cableado de máquinas que son fundamentalmente más inteligentes: máquinas biológicas».

Seung ahora está colaborando con investigadores del Baylor College of Medicine en Houston, Texas, y el Allen Institute for Brain Science en Seattle, Washington, para construir una nueva comunidad en línea, Pyr (como en, ‘Pyr into the brain’), para mapear una parte aún mayor del cerebro del ratón. En octubre, el equipo del Instituto Allen, dirigido por Clay Reid y Nuno da Costa, describió el método utilizado para recopilar esos datos. Utilizando seis TEM de la década de 1980 equipados con cámaras de gran campo de visión y un sistema personalizado de manipulación de muestras de carrete a carrete, el equipo obtuvo imágenes de un milímetro cúbico de la corteza visual del ratón en 6 meses, lo que arrojó 2 petabytes de datos. Ahora el equipo está buscando escalar sus operaciones al nivel de todo el cerebro, dice Wenjing Yin, un científico del Instituto Allen que ayudó a desarrollar la canalización de imágenes. «Hay muchas preguntas y problemas que debemos resolver», dice.

Con unos 70 millones de neuronas de ratón aún sin cartografiar, la comunidad del conectoma tendrá mucho trabajo por delante. Pero Helmstaedter es optimista. «Es un momento extremadamente emocionante para trazar nuevos territorios», dice, «con todas las sorpresas que esto siempre conlleva».

Nature 586, 631-633 (2020)

doi: https://doi.org/10.1038/d41586-020-02947-5

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